Inicialmente precisamos do arquivo no formato mult-FASTA ou aln. Para carregá-lo no Clustalx pode-se utilizar o menu File e acionar a opção Load Sequences ou usar tecla de atalho Ctrl+O, como mostra a figura abaixo. Após a carga do arquivo pode-se verificar que as linhas representam sequências de DNA e, na parte inferior do software, encontra-se gráfico que indica o grau de conservação. O fundo colorido indica o grau de conservação em regiões conservadas para a caracterização dos aminoácidos. Cada cor possui regras, que estão representadas na figura abaixo. O terceiro menu na parte superior "Alignment", possui outros sub-menus que permitem ajustar os parâmetros que configuram os alinhamentos. Pode-se clicar na opção "Multiple Aligment Parameters" para configurar os seguintes parâmetros.

• Gap Opening- penalização de escore para iniciar uma região de "Gap".
• Gap Extension- penalização de escore para estender uma região de "Gap" (normalmente menor que o Gap Opening)
• Delay Divergent Sequences - atraso de alinhamento de sequências divergentes que somente serão alinhadas após as outras sequências (porcentagem de identidade abaixo da qual a sequência será considerada divergente)
• Transition Weight (somente DNA) - da a transições (A<->G, T<->C) um escore diferente de 0.
• Use negative matrix - permite o uso de matrizes negativas, importante quando as sequências forem relacionadas somente em uma pequena porção. Em condições normais prejudica um pouco o alinhamento.
• Protein Weight Matrix - matriz de substituição a ser utilizada. Note que você só escolhe a serie de matriz: Blosum, PAM etc, o tipo de matriz dentro desta série (por exemplo Blosum 62, blosum 80) é escolhido automaticamente pelo programa.

• Residue-specific Penalties - considera a vizinhança de alguns resíduos como mais ou menos favorável para a abertura de "Gaps".
• Hydrophilic Penalties - aumenta a chance de Gaps em regiões ricas em resíduos hidrofílicos que, usualmente, representam regiões menos estruturadas.
• Hydrophilic Residues - especifica quais resíduos são considerados hidrofílicos.
• Gap Separation Distance - número de resíduos de distância de uma região com Gap na qual é penalizada uma nova abertura de Gap.

A apresentação de resultado de um alinhamento no ClustalX é representada por símbolos que indicam a conservação e os resíduos ou grupos de resíduos em uma coluna.

• Low Scoring Segments - mostra, em cinza, regiões com baixo escore e que, portanto, não seriam muito confiáveis

Também é possível exportar o alinhamento em formato Postscript através dos atalhos Ctrl+P ou acionando o menu File opção Write Alignment as Postscript. A visualização do arquivo pode ser feita por meio de um visualizador de imagens.